转录组测序分析专题

转录组数据分析一般流程

转录组测序原理

中心法则

普通转录组测序实验流程图-RNA-Seq

当RNA总量较低时，会导致建库成功率低，或数据dup率高等问题。

样品检测合格后，进行文库构建，主要流程如下：

(1) 磁珠富集真核生物mRNA（此步骤对RNA的完整性要求比较高，一般RIN值要大于8）；

(2) mRNA进行随机打断；

(3) 以mRNA为模板，合成第一条cDNA链和第二条cDNA链

(4) 进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择；

(5) 最后通过PCR富集得到cDNA文库。

文库：连接好接头的cDNA，叫做文库，英文为library

Y字接头：自身不配对，可以有效避免接头在连接的过程中自连接，用途是与flowcell上的接头进行连接

文库构建完成后，对文库质量进行检测，检测结果达到要求后方可进行上机测序，

检测方法如下：

(1) 使用Qubit2.0进行初步定量，使用Agilent 2100对文库的插入片段（insert size）进行检测，insert size符合预期后才可进行下一步实验。

(2) Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞2nM），完成库检

库检合格后，不同文库按照目标下机数据量进行pooling，用Illumina Novaseq平台进行测序

测序原理-边合成边测序（SBS）

SBS（Sequencing-By-Synthesis）：

通过单分子阵列实现在小型芯片（Flowcell）上进行桥式PCR反应。通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，再利用四种带有不同荧光标记的碱基，通过荧光激发/捕获，读取碱基信息基于可逆终止的、荧光标记dNTP，边合成边测序

Flowcell-流动池

芯片：

8条通道：内表面做了专门得化学修饰，布满了短的oligo 序列（P7/P5接头）2中DNA引物，种在玻璃表面，通过共价键连接。

液流孔：

每个lane的两端，液流流进、流出的地方

Flowcell中的每条Lane的每个面各被扫描三个道，每个道被称为一个swath

桥式PCR扩增

把文库种到芯片上去，然后扩增，文库两头的DNA序列与芯片上的引物互补，互补杂交，杂交完后，加入dNTP和聚合酶，合成双链，加入NaOH碱溶液，双链解开，加入中性液体，环境变成中性

上机测序完成之后得到的测序数据：FASTQ文件

第四行-碱基质量值

碱基质量值（Quality Score或Q-score）是碱基识别（Base Calling）出错的概率的整数映射。通常使用的碱基质量值Q公式1为：

Q=-10 * log10P

其中P为碱基识别出错的概率。下表给出了碱基质量值与碱基识别出错的概率的对应关系

碱基质量值越高表明碱基识别越可靠，准确度越高。比如，对于碱基质量值为Q20的碱基识别，100个碱基中有1个会识别出错，以此类。