单细胞转录组 | 细胞亚群人工注释

前言

前几期我们确定了我们想要的cluster，接下来就需要进入标志物识别阶段，此步骤可以帮助我们验证某些类群的身份，推测未知类群的身份，即：细胞亚群注释。

细胞亚群注释有机器注释（注释结果不一定百分百可靠）和人工注释（主观性强）。

本期我们将介绍如何进行人工注释。

本文框架

1. 安装包

如果已经安装，此步请跳过。

install.packages('Seurat')
install.packages('dplyr')
install.packages('tidyverse')
install.packages('patchwork')

2. 加载包

library(Seurat)
library(dplyr)
library(tidyverse)
library(patchwork)

3. 设置工作路径

setwd("D:/sc-seq")

根据自己的数据存放位置自定义路径

4. 读取数据

该数据为harmony后的数据。

scRNA <- load("scdata2.Rdata")

数据获取请查看：单细胞转录组 | 多样本处理与Harmony整合

5. 细胞注释

5.1 识别每个类群的全部标记物

函数格式：FindAllMarkers(object, test.use="……", only.pos = True,logfc.threshold = "……")

object：harmony整合后的对象；

test.use：检验方法；

only.pos：仅返回表达倍数大于0的基因（默认为 FALSE）；

logfc.threshold：类群中基因的平均表达量相对于所有其他类群的平均表达量的最小log2倍数。默认为0.25。

cluster_markers <- FindAllMarkers(object = scRNA_harmony, 
                   test.use="wilcox" ,
                   only.pos = TRUE,
                   logfc.threshold = 0.25) 

输出文件：

p_val：P值；

avg_log2FC：平均的差异倍数；

pct.1：以IBSP为例，即：有84.1%的0cluster的细胞表达IBSP这个基因；

pct.2：除了0cluster以外的其余cluster中表达IBSP的细胞为31.6%；

cluster：细胞cluster类群。

5.2 筛选每个cluster中表达前10的基因

# 筛选p_val<0.05的基因
all.markers =cluster_markers %>% dplyr::select(gene,everything()) %>% dplyr::filter(p_val<0.05)
# 将avg_log2FC排名前10的基因筛选出来
top10 = all.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_log2FC)

输出文件：

5.3 手动查找maker基因进行注释

我们可以通过下面的数据库进行查找maker基因进行细胞注释。这里我们以CellMarker数据库为例进行演示。

CellMarker数据库：https://panglaodb.se/index.html
PanglaoDB数据库：https://panglaodb.se/index.html

步骤：

① 在官网红框处输出你要查找的maker基因；

② 查看结果

这里数据库匹配的是"Stem cell"，实际情况下每个cluster需要多搜索几个基因再确定细胞类型，这在里因为我比较懒，所以仅以"IBSP"基因为例，展示网站使用方法。

5.4 更改cluster名

函数格式：RenameIdents(object,oldname = newname,……)

scRNA1 = RenameIdents(scRNA_harmony,"0" = "Stem cell","1" = "Osteoclast")

返回结果：

可以看到红框处"0"和"1"的cluster类群名已经被替换。

5.5 绘制图片

teneplot = DimPlot(scRNA1,reduction = "tsne", label =T)

查看图片：

0 cluster和1 cluster的类群名已经被更改。