单细胞+外泌体||10X单细胞RNA测序研究单个细胞单个EVs的转录组学特征
长久以来,我们都是在bulk水平研究细胞外囊泡,有一定的局限性,关于这个之前有一篇综述介绍了囊泡领域面临的问题与挑战:EV介导的细胞间通讯研究综述。
问题一:一个典型的哺乳动物细胞中的RNA分子含量比例如下,那么被包裹进外泌体后,RNA比例、种类、分子数如何呢?
问题二:EVs的异质性问题
囊泡的异质性一直是囊泡领域关注的一个非常重要的点,早在2021年就有一篇Nature Protocols文章:使用单囊泡技术(single-vesicle technologies)揭示细胞外囊泡的异质性。单囊泡技术可以解决囊泡异质性的三个问题:
- (1)EV 异质性的表征,包括亚群、表面(膜蛋白和脂质)组成和囊泡含量
- (2)EV膜的结构研究和可溶性蛋白质的分析以及在类似天然环境中探测这些蛋白质的代谢活性的分析
- (3)EV成分和功能的表征
ref:https://doi.org/10.1038/s41596-021-00551-z
随着越来越多的研究人员强调准确的 EV(亚)种群分类和表型的重要性,到目前为止,已经开发了20多种新的单囊泡技术。
今天介绍的这篇文章巧妙地利用10X Genomoics单细胞技术在单个囊泡水平研究其转录组学特征和异质性。文章信息如下:
文献信息
标题:Transcriptomic Features in a Single Extracellular Vesicle via Single-Cell RNA Sequencing
DOI(url): 10.1002/smtd.202200881
日期及杂志:Small Methods 2022
作者及单位:An-Yuan Guo,生命科学与技术学院 华中科技大学
主要结果
- 单个囊泡中的基因数:6-148,均值52。
- 核糖体基因、线粒体基因,真核翻译延伸因子1a在所有囊泡中的表达水平都很高
- K562-EVs中血红蛋白基因表达很高,MSC-EVs间充质干细胞囊泡中细胞骨架基因表达很高
- 囊泡存在明显的异质性:每个 single-EV dataset都可以聚成10个亚类或以上
- 不同EV亚群的细胞来源不同
EVs分离
首先对K562与MSC细胞系的外泌体进行分离:连续差分离心法
图a:透射电镜术观察到具有膜状结构的球形囊泡
图b:纳米颗粒跟踪分析确定EVs size大小:100–1000 nm,主要在100–200 nm。
图c:特征marker蛋白对EVs身份进一步验证,包括跨膜蛋白CD9,胞质蛋白Alix and TSG101,微囊泡特异性标记蛋白Annexin A1
图d:流式细胞确定EVs浓度
图e、f:完整EVs标记,calcein-AM只标记完整的EVs,不会标记膜碎片或其他碎片
10x genomics单囊泡转录组测序
图a:单囊泡的捕获以及测序,分析路线
这里有个实验技术重点:单个囊泡的捕获和测序。
单个囊泡的大小在100nm-1000nm级别,这个大小是比常规的单个细胞要小非常多的,打个比方:一个细胞体积约等于10^6个外泌体
思考:那10x genomics技术在这里形成油包水结构的时候,双包体/多胞体会出现多少?
图b、c:囊泡与空的液滴的区分,常规的细胞与空液滴之间会有一个拐点;在这里的囊泡数据中可以看到观察不到拐点
重点Note:外泌体bulk数据中的RNA含量是非常低的,那单个囊泡就更低了,文章是如何处理这个空液滴的呢?可以看原文细节~
去除空液滴之后,得到三个样本的数据:K562-EV1, 562-EV2, and MSC-EV,每个样本分别得到了2366, 4684, and 1680个囊泡。
图d、e、f:质控后的数据情况,看图的数据可以看出每个囊泡RNA含量是极其低的。
此外:作者还对细胞中的基因与counts的分布曲线与EVs中的进行了比较,结果显示这两者类似。
EVs样本的转录组特征
图a:每个样本中高表达EVs基因的交集情况,取的每个EV dataset中top500高表达基因,这里可以看到核糖体基因以及线粒体基因,血红蛋白基因占比的情况。
图b:外泌体bulk数据 vs 单个囊泡数据
图c:每个单EV数据集中基因表达最高的前10个基因
EVs的异质性
这里对EVs数据进行去批次,分群,聚类。MSC-EV dataset得到10个cluster,K562-EV数据集得到12个cluster。
图d、e展示了FindAllMarkers的结果,细看你会发现还挺有意思的:K562-EV数据集的0 cluster没有显著高表达基因等等。
细胞bulk转录组数据 vs 单个EVs转录组数据
作者直接把bulk数据与EVs数据进行了整合:可以看到每个cluster都包含了EVs与细胞,提示同一个cluster中的EVs可能是此cluster中的细胞分泌来源;同时,不同的EVs具有不同的细胞来源。
看完后,文章中有许多地方对外泌体bulk细胞转录组内容物与单个EV转录组内容物的比较:EVs中包含进来的RNA分子在表达分布,种类上看,与细胞中的好像没啥区别啊!
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