小细胞肺癌化疗耐药相关的肿瘤外显子层面差异

前面我们宣传了 重磅课程来袭-专注于肿瘤外显子数据处理，但是由于转录组是深入人心尤其是单细胞转录组的大行其道，现在的小伙伴们对基因层面的数据分析不甚了解，无论是全基因组测序， 还是外显子，基因panel的捕获测序，这些技术在人类疾病研究，尤其是肿瘤领域，也曾经是是“当红炸子鸡”。为了唤起大家的记忆，我们安排实习生解读了十几篇肿瘤外显子技术的最新应：

文章简介

• Title：「Whole exome analysis reveals the genomic profiling related to chemo-resistance in Chinese population with limiteddisease small cell lung cancer」
• Jounal：Cancer Medicine
• Factor：4.71
• Time：May 2022
• Online：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cam4.4950

1.研究背景

「目的：」小细胞肺癌(SCLC)化疗耐药的机制尚不清楚。本研究旨在通过全外显子组测序(WES)「探索SCLC新辅助化疗(NAC)后残留肿瘤耐药性相关的基因组谱」。

「实验设计:「回顾性分析416例接受手术治疗的有限疾病(LD) SCLC患者，其中40例接受NAC治疗。然后我们选择」29例」接受NAC和「10例」接受化疗的naïve 患者(「CTN)「，用福尔马林固定的石蜡包封样本」包括肿瘤和配对的肿瘤旁标本进行WES序列分析」。

「结果:」 总的来说，NAC组和CTN组的单核苷酸「变异和突变率」相似。在NAC组和CTN组之间，以及在部分缓解(PR)、稳定疾病(SD)和进展性疾病患者中，「突变特征」显著不同。NAC组「拷贝数变异缺失」明显多于CTN组。

TP53和RB1的失活是NAC和CTN组中最显著的事件。RB1无义突变在NAC组反复出现(9/19 vs. 0/9, 47.4% vs. 0%)，生存率较好，而框移缺失在CTN组频繁出现(3/9 vs. 3/19, 33.3% vs.15.8%)。综合功能富集显示，NAC组中频繁突变的基因涉及细胞周期、代谢重编程和致癌信号通路，如BTG2通路、衰老糖酵解通路、P53通路等。NAC组共有27个基因发生频繁突变，可能对「耐药」产生积极影响。PR组和SD组中与「预后」相关的BRINP3、MYH6、ST18、PCHD15等多个基因突变较多。

「结论：」新辅助治疗后驻留肿瘤「表现出不同的突变特征谱」。包括RB1无义突变，BRINP3、MYH6、ST18和PCHD15在内的多个基因在驻留肿瘤中频频发生突变，可能参与有限疾病SCLC的「化疗耐药」并影响患者的「预后」。

2.研究方法

利用全外显子测序WES，我们对19例接受NAC和10例接受naive化疗的患者（CTN）的基因组谱进行了分析。分析内容包括突变分析与拷贝数变异分析。

「数据质量控制和生物信息学分析」

上游数据处理过程中，经过高通量测序的原始数据通过碱基识别分析储存在FASTQ格式的数据中，接着过滤低质量碱基与接头，获得干净数据。干净的数据与参考基因组(B37)通过Burrows-Wheeler Aligner和Samblaster比对获取最初的BAM文件。然后，使用SAMtools Picard 和GATK，局部重新排列，并重新校准碱基质量，以生成「最终的BAM文件」，「用于计算测序覆盖和深度。」

采用MuTect和Strelka检测「体细胞单核苷酸变异(SNV)和InDel」，采用Control-FREEC或VarScan检测「体细胞拷贝数变异(CNV)「。采用ANNOVAR软件对突变识别格式进行标注，具体如下，采用Refseq和Gencode对突变位点的基因结构、基因类型和基因组特征进行标注；dbSNP, 1000人基因组SNP数据库，单核苷酸多态性数据库，肿瘤体细胞突变目录(COSMIC)以及esp6500变异数据库被用于」筛选非同义体细胞突变」；采用SIFT、PolyPhen、MutationAssessor与LRT等方法「预测非同义突变对疾病/肿瘤的影响。」通过GO数据库、KEGG、Reactome、Biocarta、PID等对信号转导和代谢途径的「功能进行标注」。选择MuSic和PathScan软件分别「筛选显著突变基因」，「分析显著突变基因的通路富集情况」。采用Control-FreeC检测「体细胞CNV」，采用GISTIC软件「评估CNV的重复性」。应用MuSiC软件分析 突变相关数据集(MRT)「将显著突变的基因与NovoDrug和NovoDR数据库进行比较」，「预测耐药相关突变和靶向基因」。

突变图谱与信号分析

体细胞SNV突变谱和特征分析「有助于在点突变水平上了解肿瘤的特征」。点突变分为六种变异类型。突变图谱分析通过对肿瘤样本和点突变类型进行聚类，以点突变数量计算点突变类型，「分析肿瘤中点突变的偏好和不同样本之间的相似性」。「基于」每个肿瘤样本中「96点突变的数量」进行「突变特征分析」，采用非负矩阵因子分解(NMF)方法提取体细胞点突变的突变特征。将肿瘤的突变特征与COSMIC数据库中30个已知的突变特征进行比较，可以反映肿瘤体细胞突变的物理、化学或生物学过程。

FFPE样本数据过滤

根据前面的描述，我们「加强过滤条件」以「排除」FFPE样品中的「人为突变」，如下所示:「采用Milup软件计算偏好」。质量控制同上;采用Milup软件计算偏好；Muttect参数调整如下:(1)使用对照样本确定随机错误率；(2)减少mutect软件的优先级；(3)扩大Indel的距离；(4)对相似读数据进行筛选(通过对所有读数据进行方差检验确定读距离)；(5)将突变负载LOD由6.3调整为1.8，以提高准确性，降低灵敏度；(6)剔除链首选C>T;T突变率>5:1和Milup文件中未统计的位点；(7) DP>10；DV >3(读取不同的起止点); (8)当变量读段≥6时，保留vaf ≥0.1位点;否则当变量读段等于 4或5时，vaf ≥0.15保留位点；(9)过滤除C>T外的其他突变类型且同向的变量读段≤2的位点。

3.结果

肿瘤外显子图谱分析：新辅助化疗(NAC)组与化疗naïve (CTN)组显著突变基因比较。

为了进一步探究复发肿瘤突变，作者利用MutSigCV的方法「分别在NAC组与CTN组筛选了33个与3个显著变异基因」，TP53与RBL1基因在这两组不同状态之间均具是最为显著的突变基因（图1A）。关于拷贝数变异，作者采用Control-FREEC软件分析体细胞中CNV和SNV位点的次要等位基因频率(BAF) ，并采用GISTIC软件评估了SCLC患者的复发频率（图1B）。NAC与CTN的整体突变频率没有显著差异，肿瘤的吸烟史或临床分期与蛋白质改变非同义突变率无关（图1C）。NAC组各样本间突变特征较为相似，C:G>A:T突变比例明显较高(p = 0.090)，而CTN组C:G>T:A突变更为普遍(p = 0.011)(1D)。共有27个频繁突变的基因NAC组影响了超过20%的样本 (图1E)，这可能与化疗耐药有关。BRINP3、MYH6、ST18和PCDH15等11个基因在PR和SD组均有复发，可能与初次耐药有关（图1F）。然而，其他7个突变基因(MAGEC1、HOXA5、ZNF729)在PR组中频繁出现，这可能与抗性发育相关(图1G)。通路综合分析发现，NAC组中突变频率较高的基因涉及细胞周期、代谢重编程以及BTG2通路、衰老糖酵解通路、P53通路等致癌信号通路(图1H)。

「图1新辅助化疗小细胞肺癌的基因组改变。」

A：「新辅助化疗(NAC)组与化疗naïve (CTN)组显著突变基因比较。」样本按底部列出的组进行排列。突变率列在最上面。显著突变基因的突变类型根据图像下方的彩色面板对每个样本进行标注。每个基因的差异显著性(p值)和患者受影响的频率依次绘制在右侧面板上。(B) NAC组和CTN组拷贝数变异(CNV)变化的比较。红色和蓝色分别表示染色体区域的扩增和缺失。(C) Upper，比较两组间突变率，采用独立t检验。「其次」，分析临床分期、吸烟状况及不同疗效对NAC组突变率及特征的影响。(D)使用非参数检验比较两组之间的「突变特征」。(E) NAC组27个频繁突变基因的受累样本比例。(F) PR和SD组均有11个基因重复出现。(G) PR组有7个基因突变频率高于SD组。(H) NAC组的频繁突变基因在11个通路中富集。PR,局部反应；SD,稳定的疾病。

新辅助化疗(NAC)组的频繁突变基因是相互作用的，可能与患者的生存有关。

作者进一步发现，与CTN组和TCGA数据库相比，「NAC组BRINP3、MYH6和ST18突变高突变」(图2A)。然后，为了研究这些显著突变的基因之间的关系，我们进行了「MRT分析（突变协同关系）」。结果表明BRINP3突变与MYH6、ST18「共发生」，与ZNF729相互排斥(图2B)。作者使用OncodriveCLUST分析来「筛选聚集突变」。此前报道的EP300和CREBBP27聚集突变在本研究中未发现。但作者发现，局部聚集突变发生在BRINP3、MYH6、COL11A1、PKHD1和SYNE1（图2C）。接着，作者发现PR和SD组中多个基因的发生与患者的生存相关（图2D-2F)。MYH6突变患者的OS率显著低于野生型患者(p = 0.032)。BRINP3与ST18突变患者的OS率显著也低于野生型患者。此外，MYH6、BRINP3和ST18突变患者的RFS也较短。

「图二：新辅助化疗(NAC)组的频繁突变基因是相互作用的，可能与患者的生存有关」

(A) 3D图表示NAC组频繁突变基因的突变率。(B)突变相关基因集 ( MRT)显示了NAC组中经常突变的基因之间的相互协同关系「（突变协同）」。(C)示意图显示MYH6、BRINP3和ST18体细胞突变在蛋白结构域上的分布。NAC为红色字体，CTN为蓝色字体。(D-F)根据MYH6、BRINP3、ST18突变与否的状态分析其与NAC组有限疾病小细胞肺癌患者的生存期的关系，两个指标，一个是整体生存率，一个是复发生存率。

「TP53和RB1丢失类型可能与患者的疗效和生存期相关」

在我们的队列和之前的三个研究中，「TP53突变类型」发生的频率相似（图3A）「。」TP53的不同突变类型在氨基酸序列上的分布不存在偏好(图3F)。与其他突变相比，TP53剪接位点突变患者的生存率有所提高，但差异无统计学意义(图3G)。既往研究表明，「RB1突变状态」是SCLC疗效和预后的良好预测因子。在我们的研究中，突变RB1在CTN长OS组和NAC PR组(图3B)更为常见，提示突变体RB1可能与良好的疗效和生存率有关。然而，Kaplan Meier分析显示RB1突变与患者生存率无关。两组RB1突变类型差异有统计学意义。「无义突变」在NAC组多见(9/19,47.4%)，CTN组无义突变(图3C)。在之前的三项研究中，我们也探讨了CTN SCLC患者的RB1突变类型。我们发现无义突变占比为12.6%与 26.3%，显著低于NAC组(p<0.001，图3D)，且主要分布在PR长OS组（图3E）。值得注意的是，PR组中有1例患者(患者P1605)存在三种RB1突变(无义突变、错义突变、剪接位点)，经过一个周期的EP方案后获得PR，并存活8年以上。「与其他类型的患者相比，无义突变患者生存率提高，尽管差异不显著(图3G)「。这些结果」提示RB1无义突变可能与更好的疗效和生存率有关」。此外，发生在氨基酸序列之后的区域的突变可能与良好的存活率相关(图3F)。

「图三：新辅助化疗患者RB1突变类型不同」

(A)新辅助化疗(NAC)、化疗naïve (CTN)及其他三项研究中TP53和RB1突变类型分数的比较。rCTN, gCTN和iCTN是Rubin研究的。(B)不同疗效和生存率的NAC组和CTN组RB1突变型与非突变型的相对比例比较 . (C) NAC组与CTN组RB1突变类型比较。(D) NAC组RB1无义突变比例明显高于其他研究。使用Fisher精确检验。(E) NAC组不同生存期稳定病(SD)组与部分缓解病(PR)组RB1突变类型比较。(F)示意图显示了RB1和TP53体细胞突变在蛋白结构域上的分布。(G)不同突变类型TP53、RB1生存分析。使用logrank测试。(H)典型示意图显示，拷贝中性LOH出现在13号染色体(含有RB1)和17号染色体(含有TP53)区域。

4.创新与结论

• 首次通过WES，对经新辅助治疗后的驻留SCLC肿瘤的基因组图谱进行研究。
• 系统地揭示了可能与SCLC耐药性和生存率相关的SCLC基因组背景。

5.局限

• 首先，这是一个小样本的回顾性研究，一些结果还需要在更大的样本中验证。
• 其次，与新鲜样本相比，FFPE样本带来了更多的人为突变、更高的假阳性率和不准确的CNV结果。
• 第三，由于SCLC的高度异质性，对同一患者进行治疗前和治疗后的比较将提供更可靠的结果。