先天性心内膜缺陷导致左心发育不良综合征

文章信息

题目：Intrinsic Endocardial Defects Contribute to Hypoplastic Left Heart Syndrome 期刊：Cell Stem Cell 日期：2022/8/17 DOI：https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.07.015

摘要

本文主要聚焦心内膜细胞在左心室发育不全中（HLHS）发挥的作用。对第83天正常胎儿心脏和第84天HLHS疾病的胎儿心脏来源的细胞、以及（病人、正常人来源的）iPSC进行诱导分化的细胞心内膜细胞进行单细胞测序分析，发现了心内膜细胞中在HLHS疾病中缺陷，HLHS来源的心内膜细胞会导致发生的EndoMT过程、血管形成功能受损。这些过程很可能在转录因子ETS以及CDH7的作用下完成。

结果

1 HLHS 相关的DNMs在发育中的endocardial cell中富集

HLHS发生的原因非常复杂，前人研究有报道先天性心脏疾病相关的一系列DNM(de novo mutation)中的一部分与HLHS相关性很大。对妊娠期83天的正常胎儿心脏组织中CD144+ 内皮细胞（endothelial cell，EC）富集后进行单细胞测序。下图展示了流程，已经聚类得到的细胞群（Figure A,B,C）。图D中，展示了HLHS相关的DNM 基因主要在内皮细胞群表达(红框中圈住的)

2 单细胞测序HLHS 的iPSC-EC 揭示出心内膜细胞的缺陷

接下来，作者将焦点聚集在内皮细胞上。研究者从正常人和HLHS患者来源的iPSC，诱导分化并富集CD144的EC细胞，进行单细胞测序，聚类分群（下图A、B、C）。从图D、图E可以看到，这些分化而来的细胞表达心内膜细胞的marker(NPR3, CDH11, HAPLN1, PLVAP)。HLHS来源的cluster6和正常control组的cluster1,2 聚在同一分支（图F）。iPSC分化得来的心内膜细胞（iEECs）中：Cluster1,2 （正常来源）的Endocardial gene表达量显著高于cluster6（HLHS来源）（图G）。图H中，能看到，control组的心内膜层CD31 和CDH11都是阳性，而HLHS组只有CD31阳性，CDH11信号降低很多。

3 HLHS的iEEC功能异常

对iEEC细胞cluster0，2，6进行功能富集分析，发现主要富集在extracellular matrix (ECM) deposition, immune system, vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling, and NOTCH signaling. 接下来主要对iEEC进行功能实验，检测正常contol组和HLHS来源的iEEC在EndoMT、细胞黏附、nothch 信号通路、angiogenesis 过程中的差异。TGFβ2 诱导endoMT后，HLHS来源的iEEC aSMA 以及其他相关基因表达下降（图B C）；不同ECM coat板后，HLHS来源的iEEC黏附数量不如正常组（图D）；HLHS来源的iEEC的 notch 相关基因表达低于正常组（图E F G）；HLHS来源的iEEC 血管形成能力显著下降（图H）

4 HLHS的iEEC负面影响心肌细胞功能

研究者假设心内膜细胞对周围的心肌细胞也有影响。研究者将目光集中在二者的crosstalk上，iEEC和iPSC来源的心肌细胞共培养后对心肌细胞进行转录组测序（图AB）。心肌细胞和不同来源的iEEC共培养后， 差异表达基因主要集中在细胞周期、心肌收缩、肌节形成（图B C）。HLHS来源的iEEC导致了与之共培养的心肌细胞功能失常，具体表现在：增殖marker表达降低（图D，图E）；收缩能力下降（图F）；肌节形成率降低（图G）；心肌成熟marker表达降低（图H）

5 心内膜的稳态功能和心内膜-心肌之间的crosstalk 主要依赖FN1

研究者有两套数据，一套是胎儿心脏的单细胞测序数据（正常胎儿、HLHS心脏）；另一套是不同病人来源的iPSC分化成内皮细胞（包括心内膜细胞）。作者将两套数据中DEGs重合，发现16个基因是两套数据共同share的（图A）。通过筛选，注意到FN1。在iEEC中（图B），在胎儿组织中（图C），HLHS组的FN1表达都是下调的。

然后，作者在胎儿来源的心内膜细胞用siRNA 敲低FN1表达后，看到FN1敲低后，心内膜细胞marker基因、endoMT相关基因降低（图D，图E）。单细胞测序数据预测心肌细胞中和FN1互作的是ITGA5和ITGB1（图F）。敲低FN1的心内膜细胞和心肌细胞共培养后，心肌细胞的增殖（图G，图H）、成熟（图I）、离子通道（图J）相关marker都有所下降。

研究者，体外增加FN1后，和HLHS 来源iEEC共培养的心肌细胞的功能有所恢复（图K-P）。

6 HLHS DNMs 主要通过转录调节心内膜基因来改变心内膜细胞和心肌细胞功能

qPCR检测到 HLHS DNMs 在HLHS中低表达（图A）；在人源的初代心内膜细胞中敲低ETS1, CDH7 后，心内膜基因NPR3，CDH11，FN1的表达降低（图B C）。图D中，iEEC细胞中的ChIP实验证明，ETS1和CDH7在NPR3的promoter上结合降低。ENCODE上的HUVEC公共数据分析以及ChIP-qPCR数据显示，ETS1和CHD7在NPR3 promoter、enhancer的结合在HLHS组降低（图E ）。

使用siRNA敲低ETS1 人源初代心内膜细胞中的表达后，EndoMT相关基因表达降低（图F）。敲低ETS1的心内膜细胞，做了和敲低FN1 细胞的类似实验，检测各种心肌细胞相关功能marker（图G H I）；再在心肌细胞中过表达ETS1，检测到心肌功能有所恢复（图K-P）

7.在非洲爪蟾蜍中抑制ETS1导致心内膜细胞的FN1表达降低且影响心脏发育

敲除ETS1的表达后，左心室的尺寸显著降低（图A B），且荧光染色显示FN1的表达显著降低（图A C）。图D是研究者提出的模型。HLHS 心内膜细胞中ETS1和CHD7的表达降低，且导致分泌的FN1降低，减弱了心内膜细胞和心肌细胞的互作，对心脏发育造成影响。