小鼠同种异体胰岛移植和同源胰岛移植的单细胞景观

文章信息

文章题目：Single-Cell Landscape of Mouse Islet Allograft and Syngeneic Graft 期刊：Frontiers in Immunology IF：8.786，JCR分区：Q1 日期：2022/06/10 DOI：https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.853349

摘要

1. Background: 目前使用胰岛移植治疗晚期1型糖尿病（T1DM）已经在临床试验中取得成功，但因免疫排斥反应，许多患者的胰岛移植物功能却在1-3年内而下降。尽管巨噬细胞、树突状细胞(DC)、中性粒细胞、自然杀伤细胞(NKs)、B细胞和T细胞等免疫细胞介导免疫排斥反应的机制已被研究，但同种异体胰岛移植物和同种异体移植物中免疫渗入的总体特征仍不清楚。
2. Method: 使用scRNA-seq来综合分析小鼠胰岛移植模型中的免疫异质性。
3. Results:

• 1）胰岛移植后7天移植物的免疫成分以T淋巴细胞和髓系细胞为主，尤其是同源移植物。
• 2）同源胰岛细胞转化为抗原提呈细胞（APC）样细胞，高表达MHC I类分子和参与MHC I类介导的抗原提呈的基因。这种转化可能极大地促进与细胞毒性CD8+T细胞的相互作用，促进同种异体胰岛移植物的破坏。

1. Discussion：该研究为胰岛移植物的转录和不同的微环境及其对免疫排斥的影响提供了洞察力。

简介

样本来源：

• 同种异体小鼠移植胰岛（C57BL/6 to C57BL/6）
• 同源小鼠移植胰岛（BALB/c to C57BL/6）

文章思路

将健康C57BL/6和BALB/c小鼠的胰腺移植到STZ诱导的1型糖尿病（T1DM）C57BL/6小鼠体内，先后对所有细胞scRNA细胞展示，并对T细胞，髓系细胞和间充质细胞三方面降维聚类。基因富集到免疫应答与细胞间沟通通路在两种移植方式之间存在差异，进一步分析了移植物中免疫细胞、间充质细胞和胰岛细胞之间的细胞间通讯。

结果

1. 单细胞分析揭示同种异体与同源胰岛移植物间细胞异质性的显著变化

Fig1.单细胞测序概述移植后7天胰岛细胞移植物中细胞成分

图1为胰岛移植后7天，胰岛细胞移植物的常规单细胞分析（共有19,640个细胞，其中11,870个细胞为同源移植物，7,770个细胞为同种异体移植物）。A. 研究流程示意图；B、C. 所有细胞UMAP降维聚类及分类（macrophages (MFs), conventional T cells (Tconvs), B cells, CD8+ T cells, dendritic cells (DCs), vascular endothelial cells (VECs), islet cells, mesenchymal cells (Mes), natural killer cells (NK), and regulatory T cells (Tregs) ）；D、E. 根据maker将不同细胞区分；F，G. 同源移植物和同种异体移植物中各种细胞分布、计数及比例（柱形图）；

### 本文使用的细胞marker
marker_gene = c("Cd4",### CD4+ T cell
                "Cd8a",###CD8+ T cell
                "Cd68", "Fcgr3a", ### macrophages 巨噬细胞
                "Clec9a", "Flt3", ### dendritic cells 树突状细胞
                "Ncr1", "Klra9",  ### natural killer cells 自然杀伤细胞
                "Cd19", "Ms4a1", ### B lymphocytes B淋巴细胞
        "Col3a1", "Fbn1", ### mesenchymal cells 间充质细胞
        "Pecam1", "Cdh5", ### vascular endothelial cells 血管内皮细胞
        "Ins", "Chga") ### islet cells 胰岛细胞

本文还分析了GEO数据库中的两种品系小鼠正常胰腺细胞的scRNA数据：GSM2230761（ICR小鼠） 和 GSM2230762（C57BL/6小鼠）。与同种异体移植物相比，同源移植物的免疫浸润更多。其中以T细胞浸润为主，包括传统CD4+ T细胞、调节性T细胞和CD8+ T细胞。健康C57BL/6小鼠和ICR小鼠胰腺中的免疫细胞数量有限，仅有小部分的巨噬细胞。

2. 同源胰岛移植中T细胞的募集和激活

Fig2.单细胞数据揭示了T细胞的分子细节和亚簇

图2的单细胞数据揭示了T细胞的分子细节和亚簇，T细胞可以被定义的有5簇，分别是：T1.高增殖潜能T细胞；T2.CD8+ T细胞；T3.自然杀伤T细胞；T4.调节性T细胞；T5.传统CD4+ T细胞。

### 淋巴细胞marker
marker_gene = c("Stmn1", "Top2a", "Dnmt1", "Ezh2", ### Dividing T cell
                "lrc1", "Klrd1", "Nkg7", "Gzmk", ### Activated CD8+ T cell
               "Xcl1", "Ccl5", "Hif1a", "Ldha", "Tnfrsf4", ### CD8+ T cell
                "Klra1", "Klrb1C", "Cd122", "Cd7", ### NKT cell
                "Il2ra", "Foxp3", ### Treg
                "Tcf7", "Tnfsf8")  ### CD4+ Tconv

Fig3.胰岛移植物中T细胞的定位(免疫荧光)

图3.胰岛移植物中T细胞的定位(免疫荧光)：相较于同种异体移植物，同源移植物中的CD4+/CD8+ T细胞数量更多。本文进行GO富集分析发现，同种异体与同源移植物之间差异最大的分子功能是免疫应答与细胞间黏附。这说明了T细胞在移植排斥中的功能，并且选择性抑制这些趋化因子受体，可以保护移植物免受免疫攻击。

3. 异位胰岛移植中巨噬细胞是主要的抗原提呈细胞

Fig4.胰岛移植物浸润髓系细胞的亚簇和分子特征

图4.胰岛移植物中4,286个髓系细胞分析。可分为6簇细胞，其中3簇为巨噬细胞（MΦ-C1, MΦ-C2, and MΦ-C3 ），3簇为树突状细胞（ DC-C4, DC-C5, and DC-C6 ），其中DCs的丰度比巨噬细胞少。H.热图显示了巨噬细胞 3 个亚簇中代表性基因的表达，并将基因按其生物学功能分类，发现参与抗原呈递和加工、趋化因子产生、细胞表面蛋白和转录因子的基因水平更高。

Fig5.巨噬细胞在胰岛移植物中的定位(免疫荧光)

综上所述，炎症巨噬细胞和DC在胰岛同种异体移植物中富集。不同来源胰岛移植物的异质性分析揭示了髓系对异种刺激的不同反应。

4. 胰岛细胞被激活以促进CD8+ T细胞在同种异体异位移植物中的相互作用

Fig6.胰岛细胞在移植后7天表现出活化的基因表达特征

图6.胰岛细胞在异体移植后7天表现出活化的基因表达特征。胰岛细胞出现3种亚簇，根据细胞marker分为β(Islet-C1), α (Islet-C2), ε (Islet-C3) 3种细胞。

### 胰岛细胞marker
marker_gene = c("Ins", "Prlr", "Igrp", ### β cell
                "Gcg", "Mafb", "Irx1", ### α cell
                "Sst", "Ly6h, "Ptprz1")  ### ε cell

进一步分析发现同源胰岛移植物中的胰岛细胞表达MHC I类分子相关基因和IFN诱导基因，这些结果表明，同源微环境中的胰岛细胞有可能转化为抗原呈递细胞样细胞。MHC I类分子高表达的这种转化特异性地促进CD8+ T细胞的相互作用。

5. 间充质基质细胞在胰岛移植物中具有高度异质性

Fig7.移植后7天间充质细胞的亚簇和分子特征

图7.间充质细胞亚簇及分子特征。根据不同细胞marker，将间充质细胞分为9个亚簇。E.通路分析发现细胞粘附和免疫应答在功能上与Mes-C2、Mes-C3、Mes-C7和Mes-C8相关。F. Mes-C3, Mes-C4, and Mes-C8这三个亚簇更多是在同源移植物中富集得到。

6. 胰岛移植物中的细胞间通讯

Fig8.移植物中免疫细胞、间充质细胞和胰岛细胞之间的细胞间通讯

图8.移植物中免疫细胞、间充质细胞和胰岛细胞之间的细胞间通讯。依据配体-受体基因表达量来评估两种细胞之间的通讯。

总结

本文应用scRNA检验技术分析了不同来源的胰岛移植物中的细胞组分差异，并对淋巴细胞、髓系细胞和间充质细胞进一步分析。也将公共数据库中的健康胰腺组织单细胞数据与移植物进行对比分析。应用免疫荧光染色进一步说明相较于同种异体移植物，同源移植物中的CD4+/CD8+ T细胞数量更多。

但本文只分析了移植后7天的情况，移植后期可能更好地反映移植排斥反应中发生的免疫反应。仅分析胰岛移植物细胞，缺乏对循环细胞的分析。在淋巴结、脾脏和PBMC上增加测序和/或FACS对于与移植物内的免疫群体和感兴趣的分子进行比较非常重要，以确保不是由于小鼠品系特异性差异。

综上所述，本文揭示了小鼠胰岛同源移植物和同种异体移植物中的微环境，包括三个主要细胞群（T细胞，巨噬细胞和间充质细胞）和五个次要细胞群（DC，NK，B细胞，VECS和胰岛细胞）。确定了胰岛同源移植物和同种异体移植物之间以前未知的微环境差异