压力超载心衰小鼠心脏免疫浸润的单细胞测序揭示了免疫激活程度

文献信息

• 标题：Single-Cell Sequencing of Mouse Heart Immune Infiltrate in Pressure Overload–Driven Heart Failure Reveals Extent of Immune Activation
• 杂志：Circulation 2019.12

简介：心脏病变中免疫过程很关键，但机制不明。

方法：

• 1、对C57BL6/J型小鼠行主动脉结扎心衰建模，以假手术组为对照组。分别取第一周、第四周心脏配对样本，每组样本用流式筛选得到CD45+细胞，随后对筛选细胞做单细胞分析。
• 2、对17853个细胞 Seurat 聚类，对聚类所得20个聚类簇用Pearson correlation analysis检测效果。
• 3、使用immune cell gene marker注释scRNA-seq的CD45+ cells。
• 4、堆积图展示免疫细胞簇丰度的ratio信息。
• 5、流式分选细胞验证细胞簇biomarker。
• 6、DESeq2识别差异基因。
• 7、GSVA分析获取不同免疫细胞簇的pathway富集分数。

结果：

1.心脏组织拥有20类免疫细胞簇，这些细胞簇与疾病发展有密切相关关系。其中丰度前三的细胞群是巨噬细胞、B细胞、NK细胞。免疫细胞簇的丰度随着疾病发展发生了变化，各个免疫细胞簇在病变过程中都有变化。

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2.分析3、4、5、8簇细胞为单核巨噬细胞，据CCR2阳性（募集）CCR2阴性（原有）区分来源。各组均有相关特异性基因表达，Cluster 3和5为阴性，3主要与促修复有关，其他的与促炎有关，在整个病变过程中均有变化。

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3.心脏中原本有大量B细胞，细胞簇0、2、11、17为四组B细胞，各簇随病变都有变化，为验证其变化，还做了免疫组化、流式细胞、免疫荧光的验证，确定心肌损伤后B细胞会被激活扩增。

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4.T细胞激活变化，CD8+和CD4+均有出现，其中CD4+更为重要，细胞簇6、15为CD8+，细胞簇9、13为CD4+，免疫组化也对生信结果做了辅助验证，应急过载时T细胞会进一步激活增加。

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5.作者还对中性粒细胞（7、16）、NK细胞（1、12）、肥大细胞（20）也分别做了分析验证，这些表达含量不多，所占比例不大，但是也随着病变有所变化。尤其是肥大细胞在20年前便已被提出与心脏病变有关，但此次单细胞测序结果并不显著，随后作者通过流式、活检确定肥大细胞有重要作用，不同于其他细胞仅存在于心肌组织中，肥大细胞的身影在心外膜上也可以见到。

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6.对所有免疫细胞做全局分析，手术组和假手术组的的差异基因表达在疾病发展过程也是动态变化的，第一周和第四周 ll1b等促炎因子基因显著富集在疾病组，在第四周则出现了Ccr2和Cd68等新的促炎因子基因。GSVA分析结果也对此提供支持。

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总结

单细胞注释分组是单细胞分析的核心，假以湿实验辅助，有很强的说服力，对每个细胞簇可以继续分类，可以对分类功能、marker gene对探究分析， Reactome gene ontology analysis 、GSVA 等对功能预测也有一定启示意义。