干货系列:高通量测序后的下游实验验证方法——m6A RNA甲基化篇|易基因
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此前,我们分享了m6A RNA甲基化研究的数据挖掘思路(点击查看详情),进而筛选出m6A修饰目标基因。
做完MeRIP-seq测序后,如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证,则需要进行下游实验设计。m6A RNA甲基化修饰目标基因的进一步验证或后期试验包括以下6个方面:
- 简单验证
- 全局m6A甲基化干扰实验(非靶向),验证m6A甲基化书否真的影响目标基因表达和细胞功能
- 靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验,检测某区域m6A修饰是否真的影响目标基因的表达
- 研究目标基因的m6A甲基化如何影响目标基因表达
- m6A修饰目标基因的表达回复实验
- 研究特定m6A Readers通过结合目标基因RNA而影响目标基因的蛋白表达
(1)简单验证
- 目标基因m6A甲基化的验证:MeRIP-RT-PCR
- 检测目标基因的mRNA表达水平:RT-qPCR
- 检测目标基因蛋白质表达水平:Western blot
![](https://pic2.zhimg.com/80/v2-8741d56d1e812d2b0bd9e575236c66b1_1440w.webp)
(2)全局m6A甲基化干扰实验(非靶向),验证m6A甲基化书否真的影响目标基因表达和细胞功能
- m6A甲基化干扰:m6A writers/erasers的突变/敲降/敲除/过表达、m6A甲基化抑制剂
如环亮氨酸、m6A去甲基化抑制剂如FTO抑制剂FB23-2 - 检测m6A甲基化整体变化:m6A甲基化免疫荧光染色(定性)、m6A斑点杂交(定性)、比色法(定量)、质谱法(定量)
- 检测目标基因的m6A甲基化变化:MeRIP-qPCR
- 检测目标基因的mRNA水平:RT-qPCR
- 检测目标基因蛋白质水平:Western blot
- 检测细胞功能/表型变化
![](https://pic4.zhimg.com/80/v2-561b60b229ab35e797256a7a95f1141b_1440w.webp)
(3)靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验,检测某区域m6A修饰是否真的影响目标基因的表达
- 目的基因m6A甲基化干扰细胞系的构建:荧光素酶活性分析实验(Luciferase activity assay)——构建含甲基化/未甲基化m6A位点的目标基因-荧光素酶表达质粒,转染细胞并表达。
- 检测目标基因的m6A甲基化变化:MeRIP-qPCR
- 检测荧光素酶报告基因的mRNA表达水平:RT-qPCR
- 检测目标基因蛋白质表达水平:Western blot
- 检测细胞功能受到的影响:免疫荧光显微观察、功能标志物测定... ...
![](https://pic2.zhimg.com/80/v2-feaafad108b425d6d6a05030f7b38915_1440w.webp)
(4)研究目标基因的m6A甲基化如何影响目标基因表达
- 检测m6A是否通过影响目标基因翻译而影响蛋白质水平:
Polysome profiling
Ribo-seq
通过对结合核糖体上的mRNA进行定量,分析目标基因的蛋白翻译效率
![](https://pic1.zhimg.com/80/v2-9eaafc642ce5b148882c62aeac238058_1440w.webp)
Polysome Profiling方法举例:
![](https://pic4.zhimg.com/80/v2-f8e18d27db62143690967e908aa925af_1440w.webp)
![](https://pic3.zhimg.com/80/v2-c88b4738df77fb0ed0af74c23d0e8b1a_1440w.webp)
研究m6A是否通过调节mRNA的稳定性和降解而影响目标基因蛋白水平
研究m6A对目标基因mRNA水平的影响
RT-qPCR
RNA-seq
![](https://pic2.zhimg.com/80/v2-165880298225b979136bbf30bb418e4d_1440w.webp)
![](https://pic1.zhimg.com/80/v2-1a97650645d446ecc19dbf48e8bfb180_1440w.webp)
- 研究m6A是否通过调控RNA的出核(nuclear export)而影响目标基因蛋白水平
裂解细胞,超速离心分离细胞核与细胞质,然后分别进行RT-PCR实验检测细胞核与细胞质中的mRNA水平
![](https://pic1.zhimg.com/80/v2-eb084136a1e2cdf40df929a65f9e157c_1440w.webp)
(5)m6A修饰目标基因的表达回复实验
- writers的突变/敲降/敲除实验:
RT-PCR检测目标基因的mRNA水平变化
Western blot检测目标基因的蛋白水平变化
检测目标基因的功能 - writers的突变/敲降/敲除后,目标基因的过表达回复实验:
检测各项表型指数、细胞增殖、分化的回复情况
![](https://pic1.zhimg.com/80/v2-ccb8fa9ece8b5c62cd499affb47df668_1440w.webp)
(6)研究特定m6A Readers通过结合目标基因RNA而影响目标基因的蛋白表达
- 合理推测结合目标基因的m6A Readers是哪一种
- Readers的突变/敲降/敲除/过表达实验:
RT-PCR验证靶基因的mRNA水平
Western blot验证靶基因的蛋白水平
Readers的RIP-qPCR验证Readers蛋白与靶基因mRNA的结合
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关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术
易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段(包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA),结合高通量测序,可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量,总RNA起始量可降低至10μg,最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域;可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。
大样本量m6A-QTL性状关联分析,传统MeRIP单个样品价格高,通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术,显著提成IP平行性,实现不同样本间相对定量,降低检测成本。
易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术:
- m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序(MeRIP-seq)
- m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序(lnc-MeRIP-seq)
- m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序(Micro-lnc-MeRIP-seq)
- 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序(MeRIP-seq2)
技术优势:
- 起始量低:样本起始量可降低至10-20μg,最低仅需1μg总RNA;
- 转录组范围内:可以同时检测mRNA和lncRNA;
- 样本要求:可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测;
- 重复性高:IP富集重复性高,最大化降低抗体富集偏差;
- 应用范围广:广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。
研究方向:
m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究
- 疾病发生发展:肿瘤、代谢疾病(如肥胖/糖尿病)、神经和精神疾病(如阿尔兹海默症/抑郁症)、炎症…
- 发育和分化:早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老
环境暴露与响应:污染、抗逆、生活方式
易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整体解决方案,技术详情了解请致电易基因。
![](https://pic3.zhimg.com/80/v2-7634d24e540a5df390c7f0a744aa87ca_1440w.webp)
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