人-食管癌组织细胞悬液制备流程

注 | 以下操作指南中涉及的消化酶以及实验方法仅供参考，实际应用过程中请根据具体情况进行细节上的调整。

背景介绍

食管：是消化管道的一部分，上连于咽，沿脊柱椎体下行，穿过膈肌的食管裂孔通入胃，全长约25厘米。依食管的行程可将其分为颈部、胸部和腹部三段。食管主要由环节肌层(内层)和纵行肌层(外层)组成。由于这两种肌肉的收缩蠕动，迫使食物进入胃，故其主要作用是向胃内推进食物。由于食管主要由肌肉细胞组成，因此我们使用胶原蛋白酶和DNA酶对食管组织进行解离。

人食管癌组织示意图

实验试剂及耗材

实验步骤

1. 准备肿瘤解离试剂盒的酶混合液，将100µL的H酶、500µL的R酶和25µL的A酶加入到4.4mL的的 RPMI 1640培养基中。
2. 组织切成直径2-4mm的小块。
3. 将组织转移到含有酶液的温和MACS C管中（冰上）。
4. 拧紧C管，并将其倒挂在gentle MACS Dissociator的套管上。
5. 运行 gentleMACS 中的 h_Tumor_01程序。
6. 程序终止后，将C管从gentleMACS解离器上拆下。
7. 使用MACSmix试管旋转器在37℃下连续旋转培养样品30min。
8. 将C管倒挂在gentle MACS Dissociator的套筒上，并运行gentle MACS解离器的程序h_Tumor_02，随后将C管置于MACSmix试管旋转器上在37℃下连续旋转培养样品30min。
9. 程序终止后，将C管从gentleMACS解离器上拆下。
10. 重悬细胞沉淀，使用置于50mL离心管上的70μm滤膜过滤。
11. 用20mL RPMI 1640冲洗滤膜，300 xg离心7min。完全吸出上清液。
12. 使用适当体积的缓冲液重悬细胞，使用台盼蓝血细胞计数仪分析细胞数量和活性。

结果及注意

细胞量：84万左右，活率91%以上，结团率14%

注：食管癌组织在取样的时候，要尽量避免掺入食道软骨或黏膜等组织，这些组织存在会使细胞悬液的杂质量增多，以及影响酶解效果